高效液相色谱仪 | C18色谱柱使用与维护（一）

什么是C18色谱柱？

C18色谱柱全称十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，是一种通用性好，广泛应用于分离和纯化有机化合物的反相色谱柱。其中C18指的是固定相的化学结构，即色谱柱填料为十八烷基硅烷键合相，这种色谱柱的固定相是通过化学键合的十八烷基官能团吸附在硅胶基质上的。有较高的碳含量和较好的疏水性，适用于大多数化合物，包括非极性、极性小分子及一些多肽及蛋白质。适用pH值范围一般为2-8，某些型号为1-14，还有一些型号可以耐受100%水相，一般型号中带有AQ，这种色谱柱即使长时间使用100%水相，也不会发生填料疏水塌陷。

色谱柱活化

1. 收到一根新色谱柱，要先阅读使用说明书，了解其中的保存液是什么，最高耐压是多少，pH值耐受范围是多少，有哪些禁用溶剂。

2. 常规C18柱的保存液通常是85%乙睛-水或85%甲醇-水，为什么不是纯有机相呢？是因为有机相易挥发，加一些水会降低挥发速度，避免填料干枯。

3. 柱体积计算，大家经常听说色谱柱活化要冲洗XX个柱体积（一般为20倍），计算公式是：柱体积=π*（柱内径/2）²*柱长度*60%，常用规格的色谱柱柱体积可以参考下表：

4. 为什么要活化？

因为色谱柱从出厂到用户手中会有一定的时间，填料可能会有些干枯，活化能让填料充分润湿、碳链舒展彻底，也能去除色谱柱中的杂质。建议使用纯甲醇或纯乙睛来活化色谱柱，用梯度时间程序的功能来便捷的进行活化过夜，以最常用的4.6mm*250mm的色谱柱为例，可以设定以下的流速梯度时间程序：（参考思路）

5. 不止是新色谱柱，旧的如一个月以上未使用的色谱柱也需要活化后再使用。一定要记得活化，不然会降低色谱柱寿命，影响色谱柱性能。活化后就可以正常使用啦，下面继续讲解色谱柱的使用。

色谱柱压力

色谱柱压力—这是非常重要的指标。

1. 养成良好的记录习惯。

启用一根新色谱柱后，用纯甲醇以及50%甲醇水等常用流动相接两通看看液相管路压力是多少，再接上色谱柱，记录下它扣减管路压力后的最初压力是多少（这是最佳状态时的压力），以后使用时能便捷的对比压力，知道它有没有堵（一般经验判断色谱柱两次使用压力在±0.3Mpa属于正常浮动）。色谱柱压力升高是需要更换保护柱柱芯或需要冲洗色谱柱的信号。

2. 色谱柱压力高了怎么办？

首先，要了解一个现象和概念：盐析（析出）。

① 什么是盐析？

盐析即高浓度（一般为20mmol/L）以上缓冲盐流动相遇到有机相不互溶从而形成结晶颗粒，这些颗粒会堵塞液相管路及色谱柱。平时会在不锈钢管路各个接头处发现白色颗粒析出，这就是盐析。

② 什么情况下容易发生盐析？

A. 非混合流动相，使用四元低压梯度液相用两个及以上流路时，梯度比例阀处容易盐析。

B. 色谱柱的保存液是纯有机相，未进行高水相过渡就直接使用缓冲盐流动相。

C. 二元高压梯度液相，因流路少不能自动冲洗色谱柱，晚上做完实验直接自动关机。

D. 未使用柱温箱，房间也没有恒温措施，夜间室温降低。

③ 怎样避免盐析？

A. 如果使用的是四元液相系统，可以优化方法，配成混合流动相来使用。或者升级改造为耐高盐比例阀。

B. 因为平时色谱柱使用后都会使用纯有机相封柱保存，建议凡是用到缓冲液类流动相（无论酸或盐）实验的之前和之后，都要使用高水相（如10%-20%甲醇水）进行冲洗10倍柱体积以上（如1mL流速30分钟以上），冲洗时不要关闭柱温箱。

以下提供两个梯度时间程序的色谱柱冲洗方法：（参考思路）

C. 如果使用的是二元液相系统，晚上做完实验后要切换到小流速 （如0.1mL）冲洗过夜，冲洗方法中柱温箱要保持温控。

D. 没有柱温箱的话可以加装柱温箱，夜里也要开空调保持房间恒  温25℃左右，低温更容易发生盐析。

要先确定是什么物质堵了色谱柱；其次，断开检测器，防止堵塞物往后走再堵塞检测器，可以接个量筒或者烧杯等。

如果是缓冲盐堵的，就得用高水相（如10%甲醇水）去冲洗，如果堵的不严重，那就用1mL流速冲洗并观察压力线；如果堵的很严重，一旦开泵就超压（20MPa）报警，那么可以用0.2mL流速冲洗过夜；如果压力还是降不下来，可以试试反冲色谱柱，一般都是色谱柱入口的柱头堵塞，反冲能有效解决。

如果平时不用或很少用缓冲盐类流动相，却总是堵塞色谱柱，那么就要注意一下流动相过滤和样品过滤问题，很可能是过滤不充分的杂质造成的堵塞，强烈建议使用0.22um的微孔滤膜及针式过滤器，还有仪器也要定期维护。

图示：瓶中有大量白色絮状漂浮物

3. 怎样防止色谱柱总是堵塞，压力变高？

① 首先要保证流动相和样品的纯净，另外可以考虑加装保护柱或者柱前过滤器。

② 保护柱：由柱套+柱芯组成，柱芯即使用了1cm长度的C18柱填料制成。等于以前会堵塞柱头，而现在会堵塞柱芯。转移了堵塞点，降低了实验室成本。保护柱可以防止污染和堵塞色谱柱，但柱芯不可以超声清洗，是一次性消耗品。

③ 柱前过滤器：由柱套+筛板组成，使用了一层各种规格的微孔筛板作为过滤杂质的防线。筛板可以反复超声清洗，堵的严重了再换新筛板，使用成本比保护柱低很多，但是只能防止堵塞，不能防止污染。

4. 色谱柱用完后怎样保存？

① 每天做完实验后按照上文的防止盐析的办法冲洗，最终用纯有机相封柱即可。

② 如果长时间不使用，可以用90%甲醇水或90%乙睛水封柱，然后取下并在两端堵上堵头（任何情况下取下色谱柱后要立即堵上堵头），放到盒子里。