本文建立了符合《中国药典》2020年版四部通则《0722 维生素D测定法》中第四法维生素D含量测定的方法。为了解决前维生素D受杂质干扰的问题，采用岛津中心切割二维液相色谱系统进行测试；在指定的二维液相色谱条件下，对照品前维生素D和维生素D在第一维液相和第二维液相中出峰良好，分离度满足要求。取对照品重复进样测试，保留时间RSD为0.26%~0.71%，峰面积RSD为0.76%~1.46%；虽然维生素D制剂供试品溶液前维生素D在第一维色谱中受杂质干扰，但在第二维色谱中成功将前维生素D与杂质分离；第一维液相色谱中维生素D理论塔板数为2511~2706，前维生素D和维生素D的分离度均大于5，第二维液相色谱中前维生素D和维生素D附近均无明显干扰峰，以上结果均符合药典系统适用性要求。结果表明，该方法有效、可靠，可以应对《中国药典》2020年版四部通则《0722 维生素D测定法》中第四法中维生素D含量的测定。