解决方案-人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品(总论)和 金培生长激素注射液(增订各论)分析
1.人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品总论简介
聚乙二醇（polyethylene，PEG）是一类由环氧乙烷聚合而成的化合物，具有一定分子量分布与亲水性特点，呈线性、分支型及其他特殊类型的分子形态。人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品是通过聚乙二醇端基的活性基团与重组蛋白或多肽的氨基酸侧链基团、N端/C端的氨基或羧基发生共价反应，修饰而成的治疗性药物。
人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品具有复杂的质量属性，制造主要包括重组蛋白和多肽的制备、聚乙二醇修饰、修饰产物的分离和纯化及制剂等过程。人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品的质量控制与修饰蛋白和多肽的分子大小、修饰位点与修饰程度、结构特征、质量属性复杂程度以及生产工艺相关。质量控制体系主要包括原辅材料的质量控制、生产工艺的过程控制以及产品检定等（表 1）。涉及重组蛋白的生产及质量控制，还应符合"人用重组DNA蛋白制品总论"及本版药典相关各论的具体要求。
注：以下内容根据2025年版《中国药典》说明整理。
表1 人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品检定要求
| 序号 | 分析项目 | 详细内容 | 检测方法 |
|---|---|---|---|
| 1 | 聚乙二醇质量控制 | 分子量及多分散性（重均/数均分子量及多分散性） | 基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、凝胶渗透色谱-多角度激光散射（GPC-MALLS）检测器或凝胶渗透色谱-示差检测器（GPC-RID）等 |
| 端基取代率 | 核磁共振（NMR）、液相色谱柱前衍生法 | ||
| 2 | 理化特性 | 修饰位点和比例（直接比较修饰前后蛋白质、采用适宜的色谱分离手段分离修饰物或异构体） | 质量肽图比对、氨基酸测序、质谱分析、实时成像毛细管等电聚焦电泳（cIEF-WCID）分析等 |
| 平均修饰率 | TNBS法/荧光胺法、液相色谱-多种检测器联用法、水解法等 | ||
| 位点异构体（修饰通常发生在赖氨酸侧链以及N端α-氨基） | 离子交换色谱法等 | ||
| 聚乙二醇修饰数目的范围及相对含量 | 基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、分子排阻色谱（SEC）、离子交换色谱、变性SDS-PAGE法或其他适宜方法 | ||
| 分子量 | MALDI-TOF-MS等 | ||
| 等电点 | 水平薄板等电聚焦电泳、毛细管等电聚焦电泳、全柱成像毛细管等电聚焦电泳等 | ||
| 空间结构（高级结构）的一致性 | 可采用适宜的方法 | ||
| 3 | 生物学活性 | 应符合“人用重组DNA蛋白制品总论”的要求 | 选择适宜的修饰前/后生物学测定方法和活性参考品 |
| 4 | 杂质分析 | 高分子物质 | 体积排阻色谱法、反相色谱法或碘染色还原SDS-PAGE法 |
| 聚乙二醇和原型蛋白残留量 | 蒸发光检测器等（残留聚乙二醇）、凝胶色谱/反相色谱（原型蛋白中残留物） | ||
| 5 | 蛋白质含量 | 修饰产物含量测定 | 适宜的理化/免疫学方法 |
| 6 | 制品检定 | 鉴别 | 反相液相肽图法 |
| 聚乙二醇修饰程度 | 可在原液阶段进行控制 | ||
| 有关物质和杂质 | 采用适宜的方法 | ||
| 效价 | 比活性 | ||
| 含量 | 适宜方法和参考品作为对照 | ||
| 安全性试验 | 成品的安全性检查应至少包括无菌、细菌内毒素等 |
长效生长激素作为人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品的代表药物，近年来在国内市场持续扩容，行业进入快速成长期。目前国内已获批及在研的人用聚乙二醇化重组生长激素注射液包括，国内首个获批上市的金培生长激素（长春金赛），已提交上市申请的怡培生长激素（厦门特宝）和进口隆培生长激素（维昇制药），以及临床试验中的安徽安科生长激素。
2.增订各论金培生长激素注射液检测要求
本版药典成功收载了金培生长激素注射液，成为全球首个收载于药典的聚乙二醇化重组蛋白制品，有效配合了"人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品总论"的落地实施，为今后其它聚乙二醇修饰重组蛋白及多肽制品的标准制定提供了范本。
金培生长激素由大肠埃希菌表达、制备的人生长激素与甲氧基聚乙二醇衍生物（40kD）进行偶联反应并经分离纯化获得的聚乙二醇单位点修饰人生长激素。该注射液的质量标准涵盖多个检测项目，下面为原液检定项目（表2）和成品检定项目（表3）的摘录。
注：以下内容根据2025年版《中国药典》说明整理。
表2 金培生长激素注射液原液质量标准
| 分析项目 | 详细内容 | 检测方法 | 质量标准 |
|---|---|---|---|
| 鉴别 | 紫外光谱 | 紫外-可见分光光度法（通则0401） | 230～360nm波长范围内测定，在277nm的波长处有最大吸收 |
| 等电点 | 电泳法（通则0541第六法方法2） | 供试品主区带等电点应为4.7～5.7；与对照品溶液的电泳图谱一致 | |
| 肽图 | 高效液相色谱法（通则0512） | 与对照品溶液的肽图谱一致 | |
| 分子量 | 质谱法（通则0431） | 5.58×104～6.82×104 | |
| 检查 | 电泳法纯度 | 聚乙二醇修饰数目的范围及相对含量 | 应不低于95.0% |
| 液相色谱法纯度 | 分子排阻色谱法（通则0514） | 应不低于95.0% | |
| 相关蛋白质 | 高效液相色谱法（通则0512） | 不得过6.0%（除多聚乙二醇化人生长激素峰、金培生长激素峰和人生长激素峰外，其他峰均视为相关蛋白峰） | |
| 游离聚乙二醇 | 高效液相色谱法（通则0512） | 不得大于对照品溶液的主峰面积（2.5%） | |
| 平均修饰率 | 质谱法（通则0431）分子量测定 | 平均修饰率应为8%～12%（重组原型蛋白或多肽中已发生修饰的基团占全部可被修饰基团的百分比例） | |
| 位点异构体 | 高效液相色谱法（通则0512） | P1含量应为43.6%～55.0%，P2含量应为14.3%～25.7%，P3含量应为6.8%～11.6%，P4含量应为6.6%～11.2%，P5含量应为9.1%～16.3%，P2至P5含量之和应为45.0%～56.4% | |
| 高分子蛋白质 | 分子排阻色谱法（通则0514） | 不得过4.0%（保留时间小于主峰的所有峰均视为高分子蛋白质峰） | |
| 人生长激素 | 分子排阻色谱法（通则0514） | 不得过1.0% | |
| 细菌内毒素 | 通则1143凝胶限度法 | 应小于5EU/mg | |
| 生物学活性 | 通则3537 | 应为标准品的70%～140% | |
| 含量测定 | 分子排阻色谱法（通则0514） | 应不低于18.0mg/ml | |
表3 金培生长激素注射液成品质量标准
| 分析项目 | 详细内容 | 检测方法 | 质量标准 |
|---|---|---|---|
| 外观 | 直接观察法 | 应为无色、澄明液体 | |
| 鉴别 | 蛋白质 | 辣根过氧化物酶（HRP）标记的第二抗体（通则3401） | 应为阳性 |
| 苯酚 | 高效液相色谱法（通则0512） | 应有与对照品溶液主峰保留时间一致的色谱峰 | |
| 检查 | 可见异物 | 聚乙二醇修饰数目的范围及相对含量 | 不得检出金属屑、玻璃屑、长度或最大粒径超过2mm纤毛和块状物等明显外来的可见异物 |
| 装量 | 分子排阻色谱法（通则0514） | 应符合规定 | |
| pH值 | 高效液相色谱法（通则0512） | 应为5.5～6.5 | |
| 渗透压摩尔浓度 | 高效液相色谱法（通则0512） | 应符合批准的要求 | |
| 相关蛋白质 | 质谱法（通则0431）分子量测定 | 不得过13.0% | |
| 游离聚乙二醇 | 高效液相色谱法（通则0512） | 不得大于对照品溶液的主峰面积（2.5%） | |
| 高分子蛋白质 | 分子排阻色谱法（通则0514） | 不得过5.0%（保留时间小于主峰的所有峰均视为高分子蛋白质峰） | |
| 人生长激素 | 分子排阻色谱法（通则0514） | 不得过1.0% | |
| 苯酚 | 高效液相色谱法（通则0512） | 2.0～2.7mg/ml | |
| 泊洛沙姆188 | 高效液相色谱法（通则0512） | 应为处方量的80.0%～120.0% | |
| 细菌内毒素 | 通则1143凝胶限度法 | 应小于5EU/mg | |
| 无菌 | 通则1101薄膜过滤法 | 应符合规定 | |
| 异常毒性 | 通则1141小鼠试验法 | 腹腔注射给药，应符合规定 | |
| 生物学活性 | 通则3537 | 应为标准品的70%～140% | |
| 含量测定 | 分子排阻色谱法（通则0514） | 应为标示量的90.0%～110.0% | |
3.人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品分析解决方案
在聚乙二醇化重组蛋白及多肽分析领域，岛津公司可提供一系列先进的色谱、质谱和光谱分析技术，全面覆盖修饰蛋白和多肽的分子量测定、修饰位点与修饰程度分析、结构特征以及杂质分析等关键需求。尤其在总论的聚乙二醇分子量及多分散性分析方法中，明确指出可采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。岛津公司的MALDI-TOF-MS 技术为聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品的分析提供可靠的技术支持。
1）分子量测定/聚乙二醇多分散性分析
台式线性MALDI-TOF质谱仪
MALDI-8020/8030
• 快速进样分析--卸载/加载样品进行分析 <3 分钟
• 检测结果直观--无需多电荷解卷积
• 质量范围宽--多肽、蛋白质、抗体分析
2）分子量测定/序列分析/翻译后修饰分析
四极杆飞行时间液质联用仪
LCMS-9030/9050
• 可靠的质量准确度--追求日常使用便利性
• 超稳定快速谱图采集--长时间快速稳定检测，减少校正和维护
• 多功能扩展性--定性和定量兼备，媲美三重四极杆的高灵敏度
3）肽段含量测定/翻译后修饰程度分析
三重四极杆质谱仪
LCMS-8060RX/8050RX/8045RX
• 出色的易用性--无需反复优化离子源参数，智能改善分析和工作流程
• 优秀的稳健性--兼具高灵敏度和稳健性，减少了由于污染引起的灵敏度下降
• 普适性参数设置--提升电离效率，提高低质量范围的灵敏度
4）含量分析/修饰程度分析/平均修饰率分析
超高效液相色谱仪
Nexera LC-40系列
• 智能、主控--可靠性强，远程监控及实验室一体化管理
• 倍速、高通--工作自动化，通量更大化
• 精巧、便捷--紧凑型和创造性结合，具备高灵敏、超低交叉污染
4.人用聚乙二醇化重组蛋白及多肽制品分析应用案例
1）台式MALDI-TOF-MS分析PEG6000分子量及分布
MALDI-TOF-MS是进行聚合物分子量检测及结构分析的常用手段之一，不仅可以快速给出聚合物的质量分布，单体结构等信息，还可以有效对聚合物的端基结构进行分析。图 1使用岛津台式MALDI-TOF-MS，检测出聚乙二醇6000（PEG6000）离子峰系列，并使用聚合物分析软件 Polymerix计算分子量分布信息。
图1 PEG6000分子量分布及单体结构信息
2）台式MALDI-TOF-MS快速分析聚乙二醇化多肽药物
分子量是评价聚乙二醇修饰多肽或重组蛋白药物的重要指标，使用MALDI-TOF-MS可检测聚乙二醇化多肽药物及用于修饰反应的多肽、聚乙二醇等原料分子量，此方法操作简便、分析速度快，可作为多肽药物修饰产物确认、快速判断聚乙二醇修饰效果，以及原料质量控制的参考（图 2）。
图2 PEG化多肽质谱图
3）SEC-UV-RI串联双检测器测定聚乙二醇化人生长激素平均修饰率
聚乙二醇 (PEG) 平均修饰率是PEG化蛋白类药物表征与质量控制中的关键属性，本方法基于"PEG化蛋白的示差信号及紫外信号等于该偶联蛋白中PEG和蛋白部分各自处于未偶联状态单独存在时所产生相应信号之和"的基本假设，成功建立了基于分子排阻色谱紫外示差双检测器串联技术的PEG化hGH (怡培生长激素) 平均修饰率测定方法（图 3）。
图3 岛津SEC-UV-RI串联双检测器分析怡培生长激素注射液分析图谱
怡培生长激素检测波长为280 nm时，对PEG-GH中PEG部分被认为无响应, 所产生的UV信号可以全部归结于hGH蛋白部分。本药典收载的金培生长激素中连接GH 蛋白和两条20 kDa PEG链的连接子与怡培生长激素相似, 理论上可以采用相同的酸水解法进行测定。
参考文章：药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2024, 59(12): 3367-3373
岛津应用资料：
1.应用台式MALDI-TOF-MS检测PEG6000的分子量及分布
2.MALDI-TOF快速分析聚乙二醇化多肽药物及原料的分子量
3.应用台式MALDI-TOF MS分析mRNA药物递送基质DMG-PEG2000的分子量分布及组成
4.使用双极性台式MALDI-TOF MS MALDI-8030进行合成肽的质量控制
5.台式MALDI-8030用于司美格鲁肽的快速合成质控
6.应用MALDI-8030表征蛋白质类药物的多聚体现象
7.利用Q-TOF定性分析多肽类药物生长抑素中的聚集体
8.利用Q-TOF结合PEAKS软件对多肽药物进行氨基酸序列确证
9.生物惰性液相结合尺寸排阻色谱法分析多肽药物中共价结合二聚体和非共价结合二聚体杂质
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