解决方案-糖蛋白的糖基化分析(增订9405)

  1.糖蛋白的糖基化分析指导原则简介

  糖蛋白的糖基化结构复杂,易产生异质性,且对治疗类糖蛋白的功能、药代动力学、药效学、稳定性和免疫原性等可能具有显著的影响,因此,糖基化分析对于药物开发中活性成分鉴定及产品质量控制等具有重要意义。《中国药典》2015年版和2020年版提出了糖基化的重要性,有部分具体方法,但缺乏糖基化分析指导原则。本版药典新增指导原则从完整糖蛋白分析、糖肽分析、寡糖分析、单糖分析4个方面详细收载了前处理方法及检测方法,指导如何选择适当的方法完成良好的糖基化分析。本指导原则适用于糖蛋白产品结构与稳定性的表征、批次放行检测和过程控制检测以及产品间可比性评估等。下图为指导原则框架。

糖蛋白的糖基化是通过糖基受体、糖基供体和糖基转移酶三类分子的协同作用将单糖或寡糖以糖苷键形式连接在蛋白质的氨基酸残基上,是蛋白质的一种翻译后修饰。本指导原则阐述了糖蛋白糖基化分析的理念、方法及应用和验证的相关要求。图1为糖基化分析的决策框架图。

  糖基化分析流程通常为一个多步骤的过程,必要时还需要进行前处理(糖蛋白分离和纯化)以去除干扰因素(如辅料、盐等)。按照完整糖蛋白分析、糖肽分析、寡糖分析、单糖分析等4种不同的互补分析方法,完成糖基化分析的全部流程。糖蛋白N-糖基化和. -糖基化分析流程可参见图2。

  通过选择适合的分析方法,可获得的糖基化信息:(1)完整糖蛋白分析:关于糖蛋白糖基化的分布等总体信息,但当蛋白分子较大并含有多个糖基化位点时,该方法提供的信息有限;(2)糖肽分析:特定糖基化位点的糖基化类型、占有率、寡糖结构信息;(3)寡糖分析:多种寡糖类型的结构(如高甘露糖型、杂合型、复杂型、唾液酸化程度等)以及相对含量的信息,从而实现寡糖的鉴别与定量;(4)单糖分析:单糖鉴别、含量及单糖组成信息。

  2. 糖蛋白的糖基化分析解决方案

  岛津在糖蛋白的糖基化分析中均有高效液相、高分辨质谱、三重四极杆质谱等多机型分析手段,应对完整蛋白分析、糖肽分析、寡糖和单糖分析。

1)分子量测定/序列分析/翻译后修饰分析(糖基化等)
 

sample

四极杆飞行时间液质联用仪
LCMS-9030/9050


• 可靠的质量准确度--追求日常使用便利性

• 超稳定快速谱图采集--长时间快速稳定检测,减少校正和维护

• 多功能扩展性--定性和定量兼备,媲美三重四极杆的高灵敏度

2)分子量测定/翻译后修饰分析(糖基化等)
 


sample

台式线性MALDI-TOF质谱仪
MALDI-8020/8030

• 快速进样分析--卸载/加载样品进行分析 <3 分钟

• 检测结果直观--无需多电荷解卷积 

• 质量范围宽--多肽、蛋白质、抗体分析 

  

3) 含量分析/修饰程度分析
 

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三重四极杆质谱仪
LCMS-8060RX/8050RX/8045RX

• 出色的易用性--无需反复优化离子源参数,智能改善分析和工作流程

• 优秀的稳健性--兼具高灵敏度和稳健性,减少了由于污染引起的灵敏度下降

• 普适性参数设置--提升电离效率,提高低质量范围的灵敏度

  

4) 含量分析/修饰程度分析
 

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超高效液相色谱仪
Nexera LC-40系列

• 智能、主控——可靠性强,远程监控及实验室一体化管理

• 倍速、高通——工作自动化,通量更大化

• 精巧、便捷——紧凑型和创造性结合,具备高灵敏、超低交叉污染

  3. 糖蛋白的糖基化分析应用案例

  1)完整糖蛋白分析:提供关于糖蛋白糖基化分布等总体信息

  .    糖基化分布、分子量:毛细管电泳法、质谱法

  .    糖基化导致的蛋白质分子量迁移:聚丙烯酰胺凝胶电泳法、毛细管电泳法

  .    蛋白片段糖基化修饰:还原酶解后质谱分析法

  .    唾液酸修饰程度:高效液相色谱法、离子色谱法、等电聚焦电泳法、毛细管电泳法

  【应用案例:台式MALDI-TOFMS应用于完整糖蛋白分析图】

 
图3 糖蛋白Ribonuclease B的质谱图


图4 Ribonuclease B的氨基酸序列和糖链修饰

  2)糖肽分析:提供特定糖基化位点的糖基化类型、占有率、寡糖结构信息

  .    糖肽富集或分离:反相/亲水高效液相色谱法、毛细管电泳法

  .    糖基化位点及糖肽结构:质谱法

  .    寡糖分子量、位点占有率:质谱法

  【应用案例:数字离子阱MALDI-TOF MS应用于糖肽结构分析】

  图5 单抗来源糖肽MS/MS质谱图 (Precursor ion m/z 2796.2)

 

图6 单抗来源糖肽 MS/MS/MS 质谱图
上图: 多肽结构分析 (Precursor ion m/z 1189.7)
下图: 含有GlcNAc的糖肽结构分析 (Precursor ion m/z 1272.7)

MALDImini™-1

 

  3)寡糖分析:提供多种寡糖类型的结构以及相对含量的信息

  .    非衍生寡糖的分离与分析:高效阴离子色谱法、多孔石墨化碳色谱法、质谱法

  .    衍生寡糖的分离与分析:色谱法、毛细管电泳法、质谱法(荧光标记衍生、紫外标记衍生、全甲基化衍生)

  【应用案例:LCMS-9030用于2-AB标记的N糖分析】

  图7 UHPLC/荧光/MS分析2-AB标记的N糖
  上图:荧光色谱图, 下图:总离子流色谱图

 表1 2-AB标记的N糖分析结果

  4)单糖分析:提供单糖鉴别、含量及单糖组成信息

  .    非衍生单糖的分离与定量分析:比色法、高效阴离子色谱法、多孔石墨化碳色谱法、质谱法

  .    衍生单糖的分离与定量分析:反相色谱法、离子交换色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法、荧光或紫外检测法

  【应用案例:LCMS用于抗体中唾液酸测定】

 
图8 唾液酸N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)标准曲线        
 
图9 唾液酸N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)标准曲线

  


表2 唾液酸分析线性结果

  糖蛋白的糖基化分析需多技术联用,未来将更注重高通量、自动化、高精度结构表征,以支撑精准药物设计与质量控制。岛津不断开发新方法,持续推出满足药典指导原则的应用方案。

  岛津应用资料:

  1、台式 MALDI-TOF MS 应用于糖蛋白质分子量测定

  2、超高效液相色谱法用于抗体中唾液酸的测定

  3、超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法用于抗体中唾液酸的测定

  以上资料,可前往岛津中国官网https://www.shimadzu.com.cn/搜索获取。