解决方案-人用抗体偶联药物制品（增订总论）分析
1、人用抗体偶联药物制品简介
抗体偶联药物（antibody-drug conjugates，ADCs）是由抗体和有效载荷（payload）通过连接子（linker）偶联而成，抗体部分包括完整免疫球蛋白、具有特异性靶点的免疫球蛋白片段以及基于抗体结构的融合蛋白等；有效载荷包括微管蛋白抑制剂和DNA损伤剂等小分子细胞毒药物。ADCs结合了抗体药物的特异性与化疗药物的杀伤力，为肿瘤治疗提供一种更加精准且有效的手段。
截至目前，全球已获批上市的ADCs药物有15种（见表1），国内已获批的ADCs药物有7种，1个本土创新ADCs药物。2021年，荣昌生物公司的爱地希成为中国首个原创ADCs产品获得批准上市，是全球首个针对Her2过表达尿路上皮癌的ADCs产品，也是我国首个同时获得美国FDA和中国国家药品监督管理局突破性疗法认定的ADCs产品。
表1 全球已上市抗体偶联药物产品信息
| 序号 | 商品名 | 通用名 | 靶标 | 首批适应证 | 首批国家/地区及时间 | 企业名称 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Mylotang | gentuzumab ozogamicin | CD33 | 急性髓系白血病 | 美国2000.05 | 辉瑞公司 |
| 2 | Adeetris* | brentuximab vedotin | CD30 | 间变性大细胞淋巴瘤 | 美国2011.08 | 武田/Seagen公司 |
| 3 | Kaleyla* | trastuzumab emtansine | HER2 | HER-2阳性转移性乳腺癌 | 美国2013.02 | 罗氏公司 |
| 4 | Besponsa* | inotuzumab ozogamicin | CD22 | B细胞型急性淋巴细胞白血病 | 欧盟2017.06 | 辉瑞公司 |
| 5 | Lumoxiti | moxetumomab pasudotox | CD22 | 复发性或难治性毛细胞白血病 | 美国2018.09 | 阿斯利康公司 |
| 6 | Polivy* | polatuzumab vedotin | CD79b | 弥漫性大B细胞淋巴瘤 | 美国2019.06 | 罗氏公司 |
| 7 | Enhertu* | trastuzumab deruxtecan | HER2 | 不可切除或转移性HER2阳性乳腺癌 | 美国2019.12 | 阿斯利康/第一三共公司 |
| 8 | Padcev | enfortumab vedotin | Nectin-4 | 局部晚期或转移性尿路上皮癌 | 美国2019.12 | Seagen/安斯泰来公司 |
| 9 | Trodelvy* | sacituzumab govitecan | Trop-2 | 转移性三阴性乳腺癌 | 美国2020.04 | 吉利德公司/Immunomedics公司 |
| 10 | Blenrep | belantamab mafodotin | BCMA | 多发性骨髓瘤 | 美国2020.08 | 葛兰素史克公司 |
| 11 | Akalux | cetuximab sarotalocan | EGFR | 头颈癌 | 日本2020.09 | Rakuten Medical公司 |
| 12 | Zynlonta | loncastuximab tesirine-hyl | CD19 | 弥漫性大B细胞淋巴瘤 | 美国2021.04 | ADC Therapeutics公司 |
| 13 | 爱地希* | disitamab vedotin | HER2 | 胃癌 | 中国2021.06 | 荣昌生物公司 |
| 14 | Tivdak | tisotumab vedotin | TF | 复发性或转移性宫颈癌 | 美国2021.09 | Seagen/Genmab/再鼎公司 |
| 15 | Elahere | mirvetuximab soravtansine-gynx | FRα | 卵巢癌 | 美国2022.11 | ImmunoGen/华东医药公司 |
* ：已批准在中国上市的ADCs产品
本总论重点阐述抗体偶联药物和其组成部分（抗体、有效载荷、连接子或有效载荷-连接子）的相关要求。涉及抗体的生产和质量控制，还应符合“人用重组单克隆抗体制品总论”和“人用重组DNA蛋白制品总论”及本版药典相关各论的要求。ADCs具体品种还应结合制品本身特性制定相关要求，质量控制应采用适宜的、先进的分析技术，从理化性质、免疫学特性、生物学活性和杂质等角度进行全面的ADCs特性分析（见表2）。
注：以下内容根据2025年版《中国药典》说明整理。
表2 人用抗体偶联药物制品质量控制及制品检定要求
| 序号 | 分析项目 | 详细内容 | 检测方法 |
|---|---|---|---|
| 1 | 一级结构和药物偶联位点 | 一级结构（如氨基酸序列） | 肽图法、质谱法（HRMS、LCMS、HPLC） |
| 翻译后修饰（如糖基化修饰） | 肽图法、质谱法（HRMS、LCMS、HPLC） | ||
| 偶联位点 | 质谱法（HRMS、LCMS） | ||
| 2 | 药物抗体偶联比(DAR) | 每个抗体上偶联的有效载荷的平均数量 | 紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法及质谱法等（UV、HIC-HPLC、RP-HPLC、HRMS、LCMS） |
| 3 | 药物载药量分布 | 偶联有不同数量有效载荷的ADC分子分别占总药物分子的比例 | 高效液相色谱法、毛细管电泳或质谱法等（HIC-HPLC、RP-HPLC、CE、HRMS、LCMS） |
| 4 | 分子大小变异体 | 聚合体分析 | 分子排阻色谱法、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、十二烷基磺酸钠-毛细管凝胶电泳或分析型超速离心等（SEC-HPLC、CE-SDS、SEC-MALS、AUC、DLS、粒子测量、LCMS） |
| 5 | 电荷变异体 | 偶联对抗体电荷异质性影响 | 离子交换色谱、毛细管区带电泳、毛细管等电聚焦电泳等、肽图法间接评估（IEX-HPLC、CZE、CIEF、iCIEF） |
| 6 | 高级结构 | 由氨基酸序列和翻译后修饰共同决定 | 圆二色光谱（CD）、差示扫描量热法（DSC）、动态光散射法（DLS）和红外光谱法（IR）等 |
| 7 | 生物学活性 | 评估偶联对抗体免疫学性质（如抗原结合活性）影响 | ELISA、表面等离子体共振法等 |
| 8 | 杂质分析 | 工艺相关杂质（如游离有效载荷及其相关物质、残留溶剂及重金属等） | 高效液相色谱法、气相色谱法、光谱法、质谱法等（HPLC、GC、LCMS、HRMS、GCMS、ICP、ICPMS）定性和/或定量评价 |
| 产品相关杂质 (如二硫键错配变异体、未偶联抗体、杂质偶联 ADC、未偶联连接子、游离有效载荷及其衍生物、副反应产物等) | 分子排阻色谱法、高效液相色谱法、质谱法等（SEC-HPLC、HPLC、LCMS、HRMS）定性和/或定量评价 | ||
| 9 | 污染物 | 包括所有偶然引入的、且不属于生产工艺预期使用的物质（如微生物、内毒素、其他可能涉及的外源因子等） | 微生物限度检查、细胞内毒素检查、异常毒性检查等 |
| 10 | 蛋白质含量 | 测定蛋白含量 | 分光光度法等适宜的物理、化学、免疫学方法 |
2、人用抗体偶联药物检测解决方案
面对抗体偶联药物日益严格的质控要求，岛津在抗体偶联药物研发、生产、质控和临床试验阶段均有一系列的色谱、质谱、光谱等多机型分析手段，应对ADCs的一系列分析需求，例如：分子量测定、序列分析、翻译后修饰分析、电荷异质性分析、杂质分析、细胞培养过程监控、药代动力学分析等。
1）细胞培养分析方法包同时分析抗体细胞培养上清液和细胞内144种组分
三重四极杆质谱仪
LCMS-8060RX/8050RX/8045RX
出色的易用性——无需反复优化离子源参数，智能改善分析和工作流程
优秀的稳健性——兼具高灵敏度和稳健性，减少了由于污染引起的灵敏度下降
普适性参数设置——提升电离效率，提高低质量范围的灵敏度
2）ADCs分子量测定/序列分析/翻译后修饰分析（含二硫键和糖型分析）/DAR值分析
四极杆飞行时间液质联用仪
可靠的质量准确度——追求日常使用便利性
超稳定快速谱图采集——长时间快速稳定检测，减少校正和维护
多功能扩展性——定性和定量兼备，媲美三重四极杆的高灵敏度
3）ADCs杂质分析/电荷变异体分析/分子大小变异体分析/药物抗体偶联比分析
生物惰性液相
Nexera XS/Lite inert
优异的灵敏度和回收率——消除因金属吸附造成的样品损失
出色的耐受性和分离度——轻松应对高盐浓度和极端pH流动相的挑战
更高的可靠性和重现性——避免金属管路对化合物的吸附
4）ADCs肽图分析/糖型分析
超高效液相色谱仪
Nexera LC-40系列
智能、主控——可靠性强，远程监控及实验室一体化管理
倍速、高通——工作自动化，通量更大化
精巧、便捷——紧凑型和创造性结合，具备高灵敏、超低交叉污染
3、人用抗体偶联药物检测应用案例
1)利用疏水色谱法（HIC）分析ADCs药物抗体偶联比
ADCs 中偶联小分子的异质性会影响 ADCs 疗效，使用 HIC 有效进行单抗异构体和 ADCs 异质性的分析。在未经过前处理的情况下分析 ADCs，分析条件见表 3 ，评价药物抗体偶联比（DAR）。结果成功分离小分子药物结合数为 0~6 的不同 ADC（图 1）。
图1 DAR分析结果
2)使用分子排阻色谱法（SEC）分析ADCs杂质
ADCs 杂质（如聚集体和降解物）是影响药物疗效、不良反应、药物稳定性的重要因素。通常使用 SEC 对此进行评价。此次聚集体分析，是使用 mAb 标准品（市售）和含有相同 mAb 偶联小分子化合物的 ADCs 标准品（市售）。分析条件见表 4。在 ADCs 的聚集体评价中，固定相与 ADCs 之间疏水性相互作用，常会导致色谱峰展宽，从而无法准确进行聚集体评价（图 2A）。因此，为了抑制样品与固定相之间的疏水性作用，流动相中添加了15%的异丙醇。结果表明，分离效果良好（图 2B）。
图2 mAb及ADCs色谱图
岛津应用资料：
1. 利用LCMS-9030对NISTmAb进行整体蛋白分析
2. 利用LCMS-9030进行曲妥珠单抗药物肽图分析
3. 利用LCMS-9030进行英夫利昔单抗药物肽图分析
4. 采用LCMS-9030进行曲妥珠单抗药物二硫键分析
5. 利用岛津高效液相色谱与单四极杆质谱联用系统对曲妥珠单抗进行肽图分析
6. 应用蛋白质测序仪PPSQ-53A测定曲妥珠单抗的N-末端氨基酸序列
7. 利用超高效液相色谱仪连接荧光检测器和四极杆飞行时间质谱仪对曲妥珠单抗游离N糖进行分离与鉴定
8. 化学修饰抗体的简易质谱测定
9. 疏水作用色谱法（HIC）在抗体药物偶联物（ADC）药物抗体比值（DAR）和药物分布测定中的应用
10. 分子排阻色谱法测定单克隆抗体分子大小变异体的高效方法开发
11. 在线二维液相色谱法分析单抗药物滴度和大小变异体
12. 使用生物惰性超高效液相色谱仪分析抗体药物
13. 生物兼容液相在单抗样品电荷异质性分析中的应用
14. 使用FTIR光谱法测定单克隆抗体的蛋白质二级结构
15. 岛津高效液相色谱联合三重四极杆质谱测定抗体药物中2-脱氧-2-氟-岩藻糖的残留
16. 超高效液相色谱法用于抗体中唾液酸的测定
17. 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法用于抗体中唾液酸的测定
18. 利用电感耦合等离子体发射光谱仪测定单抗药物中消泡剂残留量
19. 顶空-气相色谱法分析药物中的有机溶剂残留
20. 使用生物惰性超高效液相色谱仪分析抗体药物
21. 生物兼容液相色谱仪与多角度光散射检测器联用测定曲妥珠单抗主成分及聚集体分子量
22. Nexera Bio液相色谱系统用于阿达木单抗的聚集体分析
23. 岛津生物兼容液相Nexera Bio联合蒸发光散射检测器测定抗体药物中吐温80的含量
24. 基于nSMOL技术和Skyline软件的曲妥珠单抗LC-MS/MS定量分析方法开发
25. 基于EreximTM技术对曲妥珠单抗的N-多糖微观异质性进行结构表征
26. 细胞培养上清液分析技术在抗体生产细胞培养工艺筛选中的应用
27. 利用ICPMS-2030监控细胞培养上清液中无机元素含量变化
以上资料，可前往岛津中国官网https://www.shimadzu.com.cn/搜索获取。