复方氨基酸制剂、多肽类药物、蛋白质类药物、含氨基酸/多肽/蛋白质的组织提取物类药物和中药等药品中氨基酸的组成或含量的检测,需通过氨基酸分析方法来实现。
氨基酸分析系指采用适宜的方法测定蛋白质、多肽或其他药物制剂中氨基酸组成和(或)含量。蛋白质和多肽的氨基酸分析,需要将样品先水解成游离的氨基酸才能进行分析,游离氨基酸通常需要衍生化后才能测定。
欧洲药典、英国药典、美国药典及日本药典中均收载了氨基酸分析指导原则,《中国药典》2025年版首次收载9120氨基酸分析指导原则。《中国药典》收载的复方氨基酸注射液、多肽类药物及中药品种,均需采用氨基酸分析方法测定药品中氨基酸含量或氨基酸组成。该指导原则指导药典标准执行过程中如何选择适宜的氨基酸分析方法,主要内容包括基本要求、蛋白质和多肽样品的水解、氨基酸测定法和数据处理。
序号 | 方法 | 类型 | 选型考虑 |
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1 | PITC柱前衍生的RP-HPLC法 | 柱前衍生 | 该法具有仪器配置要求不高、实验成本低、分离效果好等优点,适用于含氨基酸种类较多的样品分析。胱氨酸或半胱氨酸衍生物不稳定,无法定量;色氨酸与鸟氨酸的分离困难,不适合同时含有色氨酸和鸟氨酸样品的含量测定;除PTC-胱氨酸不稳定外,其他PTC- 氨基酸衍生物溶液在室温条件下至少可稳定24小时。 |
2 | AQC柱前衍生的RP-HPLC法 | 柱前衍生 | 该法具有分离效果好、衍生物稳定等优点,适用于含氨基酸种类较多的样品分析。该法的衍生试剂价格高,AQC-氨基酸衍生物在室温下至少可稳定1周。 |
3 | OPA&FMOC柱前衍生的RP-HPLC法 | 柱前衍生 | 该法具有可自动化柱前衍生、实验成本低、分离效果好等优点,适用于含氨基酸种类较多的样品分析。二级氨基酸的衍生重复性较差及色谱柱使用寿命较短; OPA- 氨基酸衍生物不稳定,衍生反应结束后需立即进样分析;衍生化操作也可由具有自动衍生功能的进样器完成。 |
4 | DNFB柱前衍生的RP-HPLC法 | 柱前衍生 | 该法具有仪器配置要求不高、实验成本低的优点,但分离效果一般,适用于含氨基酸种类较少的样品分析 。DNP- 氨基酸衍生物溶液在室温下至少可稳定24小时;2,4-二硝基氟苯属易爆剧毒物质,有强致癌性,实验过程中应做好防护措施。 |
5 | 茚三酮柱后衍生法——锂系统 | 柱后衍生 | 该法使用氨基酸分析仪,具有自动化程度高、不易受基质干扰、重复性好等优点,适用于分析成分复杂样品。但色谱柱价格高、分析时间长、流动相制备复杂、部分氨基酸难于达到基线分离(如异亮氨酸和亮氨酸间的分离):采用温度梯度可以改善分离效果;尽量使用稀释液作为最后一步制备供试品溶液和对照品溶液的溶剂。 |
6 | 茚三酮柱后衍生法——钠系统 | 柱后衍生 | 该法使用氨基酸分析仪,具有自动化程度高、不易受基质干扰、重复性好等优点,适用于分析比较简单的氨基酸混合物。 |
综合解决方案覆盖指导原则分析方法外,针对药品研发和质量研究,可提供氨基酸构型组成分析,专业的蛋白质测序仪将对反应单元和快捷液相色谱分析单元提供控制功能,便于进行序列分析。
典型方案及应用案例
1、自动柱前OPA-FMOC分析方案
方案特色:参考药典指导原则,使用岛津氨基酸全自动柱前衍生方法包(AJS-01),适配多型号岛津液相,自动进样器自动衍生,重复性好,结果准确。
岛津氨基酸全自动柱前衍生方法包(AJS-01)含氨基酸专用分析柱、氨基酸混合标准溶液、衍生试剂、缓冲液和内标溶液,支持岛津全系列液相色谱仪,即装即用,利用自动进样器自动衍生,高效便捷。
图1. 22种氨基酸混标色谱图(含两种内标,上:338 nm,下:262 nm)
司美格鲁肽氨基酸组成和氨基酸比值分析结果
司美格鲁肽是一款用于糖尿病治疗和体重管理等病症的明星多肽药物,主链由17种31个氨基酸组成。参考指导原则对司美格鲁肽样品分别进行盐酸水解和氢氧化钠水解处理,由于盐酸水解多肽会破坏色氨酸结构,所以利用氢氧化钠水解法分析司美格鲁肽中的色氨酸。
司美格鲁肽样品中检出17种氨基酸,与理论氨基酸组成一致。氨基酸比值与理论值的相对误差在0.10~8.86%之间,结果准确。17种氨基酸的回收率在93.8~110.8%之间,方法可靠。
司美格鲁肽样品色谱图
2、自动柱后茚三酮衍生法分析方案
方案特色:参考药典指导原则,使用岛津氨基酸分析仪 LC-16AAA,试剂、耗材、专用软件配套齐全,可全自动、高效、准确地测定样品。
岛津氨基酸分析仪 LC-16AAA,结合配套流动相、标准品和衍生试剂,以及简单易操作的专用软件,软件内置实验方法,可全自动进行样品测试。
17 种氨基酸标准溶液(200 nmol/mL)图谱
某多肽药物样品色谱图
根据“9120 氨基酸分析指导原则”氨基酸测定法--方法六中规定,一般选择水解处理中稳定的氨基酸用于多肽的定量;在本例中,有6种水解稳定的氨基酸被选做多肽定量,同时指导原则也指出多肽样品的氨基酸比值由各氨基酸的浓度除以多肽的平均浓度获得,该样品各氨基酸浓度及比值分析结果如上表所示。
3、D/L 氨基酸构型分析 LMSMS缩宫素分析案例
L型氨基酸属于天然存在的氨基酸构型,可合成蛋白质,作为营养物质在人体内大量存在,而 D型氨基酸体内含量极低,多为人工合成,但它对于发酵食品成分分析、生理功能分析、颅神经系统分析和生物标志物检索等各个领域中起着至关重要的作用,甚至关乎人类的健康和美丽。
氨基酸(除了甘氨酸)都有一个手性碳原子相邻的羧基。氨基酸手性中心的立体异构会形成一对以彼此为镜像的立体异构。结构彼此十分相似,就好像的左手、右手。这些镜像被称为对映异构体。
D/L两种氨基酸成分分析经常受到各种各样的肽或氨基化合物的背景干扰,分析难度大,并且传统的氨基酸异构体分析必需进行氨基酸的衍生化处理,分析时间长(通常分析时间超过 10 小时)。因此急需建立灵敏、高效的分析方法。
面对氨基酸异构体的分析难点,岛津推出 LC/MS/MS D/L氨基酸分析方法包。本方法采用手性色谱柱实现在 10 分钟之内完成高灵敏度的氨基酸异构体的分离和检测,同时结合LCMS-8045/8050/8060 的高灵敏度分析能力可省去氨基酸衍生化的实验流程。
42 种 D/L 型氨基酸 MRM 色谱图总图(分析方法包推荐色谱柱一)
42 种 D/L 型氨基酸 MRM 色谱图总图(分析方法包推荐色谱柱二)
对缩宫素药物进行酸水解和检测,由分析结果得出,在该多肽水解样品中共检测到 12 种氨基酸,其中 D型氨基酸5 种、L型氨基酸5 种。Cys-Cys 二硫键未打开,Tyr 部分水解被破坏,Gln 水解转化为 Glu,Asn 水解转化为 Asp,因此 Cys、Gln、Asn 三种氨基酸未检测到,DL-Pro 是一种仲胺,不能用当前分析条件分离,Gly无手性。
水解样品总 D/L型氨基酸色谱图
4、蛋白测序仪测定多黏菌素B的氨基酸序列
PMB(多黏菌素B)为发酵的多肽类抗生素,组分种类较多,其中占比较高的四种主要组分包括B1、lle-B1、B2、B3,组成氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、二氨基丁酸,除苯丙氨酸的构型为D型外,其余氨基酸均为L型。目前对多黏菌素B结构的研究主要为氨基酸组成成分、氨基酸构型分析等,鲜有氨基酸序列的研究报道。
氨基酸序列是其能否正确发挥生物活性的重要基础,有必要对多黏菌素B的氨基酸序列进行确证。对氨基酸构型的分析方法包括水解后的手性衍生-色谱/质谱法、直接采用手性色谱分析,然而这种方法测定的是氨基酸混合物,无法确定每个位点的氨基酸及其构型。
Edman降解法可以弥补以上缺陷,从N端开始测定每个位点的氨基酸,但需裸露出N端氨基酸的a-氨基。本研究以B2组分为例,对其进行分离纯化和酶解后,获得去除N-酰基脂肪链及1位二氨基丁酸的肽链解除了N端封闭,通过PPSO-53A测定其氨基酸顺序。该方法操作简单、检测灵敏可靠,可作为多肽类抗生素氨基酸序列分析时的参考。
PTH-氨基酸混合标准品校准测试图谱
DABA 标准品测试图谱
经酶解处理的 PMB2 氨基酸序列分析色谱图
经酶解处理的 PMB2 氨基酸序列分析色谱图
由图可知,样品氨基酸序列为 Thr-DABA-X-DABA-Phe-Leu-DABA-DABA-Thr(x代表无信号检出),与理论顺序一致。第三位氨基酸在原构型中与相邻氨基酸为环状连接当 Edman 反应发生时,一端被切开,另一端仍与相邻氨基酸相连,因此在检测中理论无氨基酸信号产生。